Pruebas de detección de inhibidores

La prueba Bethesda se utiliza para cuantificar la concentración de anticuerpos inhibidores en una muestra de plasma. La prueba de anticoagulante lúpico (LA) puede utilizarse para investigar la presencia de anticuerpos antifosfolípidos.

La prueba Bethesda¹ se utiliza para cuantificar la concentración de anticuerpos inhibidores en una muestra de plasma. Al mezclar diluciones en serie de plasma de prueba con plasma normal, los aloanticuerpos o autoanticuerpos inhibidores en el plasma de prueba neutralizan la actividad de los FVIII o FIX (u otro factor de coagulación) en el plasma normal. La actividad del factor FVIII o FIX en el plasma normal, se podrá detectar en diluciones lo suficientemente altas del plasma de prueba que contengan el inhibidor, lo que permitirá la cuantificación del título del inhibidor con base en la actividad residual y al factor de dilución de la muestra. La modificación Nijmegen de la prueba de Bethesda² reduce la incidencia de resultados falsos positivos y se utiliza ampliamente para la cuantificación de inhibidores en la actualidad.

Prueba modificada de Nijmegen-Bethesda

Las diluciones en serie realizadas en el plasma con deficiencia del FVIII se mezclan con un volumen equivalente del pool de plasma normal regulado con imidazol 0,1 M a pH 7,4. El plasma normal mezclado con plasma deficitario en factor, sometido a inmunodepleción, se utiliza como control negativo (sin inhibidor; 100% de actividad). Luego de la incubación, se mide la actividad del factor residual mediante una prueba estándar de coagulación basada en el tiempo de tromboplastina parcial activada (aPTT) de una etapa.

El Principio subyacente de las pruebas modificadas de Nijmegen-Bethesda para cuantificar el título del inhibidor.

Cálculo del título del inhibidor

Una unidad Bethesda (BU)  se define como la cantidad de inhibidor en una muestra de plasma capaz de neutralizar el 50% de una unidad (1 IU/mL) de actividad del FVIII en plasma normal luego de 2 horas a 37°C. El principio de medición de la actividad del FIX en presencia de inhibidores es el mismo, pero no requiere de un tiempo de incubación. Las diluciones que generan mediciones de actividad del factor más cercanas a 50% (pero >25% y <75%) del control se utilizan para calcular el título del inhibidor. Por lo general, si la actividad del factor residual es >80%, se considera que no hay ningún inhibidor presente.

Por ejemplo, una muestra diluida 1:16 con 50% de actividad en relación con la reacción de control tiene un título de inhibidor de 16 BU (50% de actividad = 1 BU multiplicada por un factor de dilución de 16). El título del inhibidor también puede calcularse mediante una representación que grafique BU vs la actividad del factor residual multiplicada por el factor de dilución de la muestra.

Cinética del inhibidor

Los aloanticuerpos inhibidores, que generalmente se observan en pacientes con hemofilia A (HA) o B (HB) tratados con concentrados de factor, presentan una cinética tiempo versus actividad lineal de primer orden (tipo 1).³ TEstos anticuerpos pueden neutralizar completamente la actividad del FVIII o FIX.

En cambio, los autoanticuerpos, tales como los que se observan en personas con hemofilia A adquirida (AHA), suelen presentar una cinética no lineal de segundo orden (tipo 2) y no son capaces de inhibir completamente la actividad del factor, incluso en concentraciones máximas.3 En caso de falta de experiencia personal, se sugiere que la evaluación de la cinética en pruebas de autoanticuerpos sea realizada en consulta con un experto que posea la experiencia necesaria.

Se debe poner especial atención en casos de pacientes cuya actividad del FVIII residual sea medible, ya que es posible que la prueba modificada de Nijmegen-Bethesda no detecte la presencia de inhibidores adecuadamente. En tales casos, el agregado de un paso de termoinactivación puede ayudar a mejorar la exactitud de la prueba⁴.

El anticoagulante lúpico (LA; 2017 ICD-10-CM: D68.312) es un autoanticuerpo que se enlaza a los fosfolípidos y a las proteínas de la membrana celular que puede desencadenar efectos trombóticos. Por el contrario, el LA in vitro se asocia con un aumento en los tiempos de coagulación mediante la prueba de aPTT como resultado de la unión con los fosfolípidos en la reacción.⁵

Otras de las pruebas de mayor precisión para confirmar la presencia de anticuerpos antifosfolípidos LA son la prueba del veneno de la víbora de Russell diluido (dRVVT), el procedimiento de neutralización de plaquetas (PNP) y el tiempo de coagulación con caolín (KCT).

Prueba del veneno de la víbora de Russell diluido ⁶

El veneno de la víbora de Russel (RVV) activa directamente el FX de coagulación, lo que a su vez convierte la protrombina en trombina en presencia del FVa y de fosfolípidos.

Se incuba un pool de plasma normal o plasma de prueba con fosfolípidos a 37 °C y se añade el RVV diluido y calcio para iniciar la coagulación y se mide el tiempo de coagulación. La relación del tiempo de coagulación del plasma normal y del plasma de prueba determina si la coagulación está afectada. Cuando ya se ha excluido una deficiencia en los factores de la vía de coagulación común (I, II, V, X), una relación de >1,05 sugiere la presencia de LA.

La presencia de un anticoagulante lúpico interfiere con esta reacción uniéndose a los fosfolípidos, lo que produce tiempos de coagulación prolongados. Cuando el tiempo de coagulación se corrige durante los estudios de corrección con una mezcla 1:1 de plasma de prueba y normal, esto sugiere una deficiencia de factor, no obstante, dado que el RVV activa el FX directamente, la prueba no se ve afectada por la vía intrínseca (o de activación por contacto). Si utilizando estudios de corrección y agregando fosfolípidos en exceso, el tiempo de coagulación no se corrige, esto indica la presencia de LA.

Tiempo de coagulación con sílice

El tiempo de coagulación con sílice (SCT) es esencialmente una prueba de aPTT que utiliza sílice como activador por contacto en presencia de plasma pobre en plaquetas y una baja concentración de fosfolípidos, seguido de la incorporación de calcio como una prueba de precisión para la detección de LA.⁷

Procedimiento de neutralización de plaquetas⁸

El procedimiento de neutralización de plaquetas utiliza membranas  plaquetarias alteradas, lavadas como fuente de fosfolípidos en exceso para probar si el aPTT se puede normalizar neutralizando el efecto de un anticuerpo LA.

Tiempo de coagulación con caolín⁹

El KCT es sensible para la detección de LA y sigue el mismo principio que el aPTT, pero en vez de fosfolípidos, utiliza lípidos del plasma y fragmentos de membrana celular. La prueba puede utilizarse para detectar cualquier tipo de inhibidor de la coagulación, incluidos anticuerpos dirigidos contra fosfolípidos y FVIII.

Se mezcla el plasma normal con el plasma del paciente en proporciones de entre 1:10 y 10:1 en presencia de caolín y calcio, y se mide el tiempo de coagulación. Una proporción de muestra de prueba:control >1,2 sugiere la presencia de un inhibidor. En caso de que el KCT sea prolongado, se puede excluir la deficiencia de un factor agregando plasma normal en exceso. Si el KCT no se corrige en presencia de factores de coagulación normales, esto sugiere un inhibidor de coagulación, pero es posible que no excluya un autoanticuerpo de factor de coagulación. Se puede aplicar el índice de Rosner o las proporciones de Chang al análisis del KCT para calcular límites que distingan entre corrección y no corrección.

1. Kasper CK, Aledort L, Aronson D, et al. Proceedings: A more uniform measurement of factor VIII inhibitors. Thromb Diath Haemorrh 1975;34:612.

2. Verbruggen B, van Heerde WL, Laros-van Gorkom BA. Improvements in factor VIII inhibitor detection: From Bethesda to Nijmegen. Semin Thromb Hemost 2009;35:752-9.

3. Ma AD, Carrizosa D. Acquired Factor VIII Inhibitors: Pathophysiology and Treatment. Hematology Am Soc Hematol Educ Program 2006:432-7.

4. Millner AH, Tiefenbacher S, Robinson M, Boesen HT. A variation of the Nijmegen-Bethesda assay using heat or a novel heat/cold pretreatment for the detection of FIX inhibitors in the presence of residual FIX activity. Lab Hematol 2016;38(6):639-647.

5. Keeling D, Mackie I, Moore GW, Greer IA, Greaves M, British Committee for Standards in H. Guidelines on the investigation and management of antiphospholipid syndrome. Br J Haematol 2012;157:47-58.

6. Thiagarajan P, Pengo V, Shapiro SS. The use of the dilute Russell viper venom time for the diagnosis of lupus anticoagulants. Blood 1986;68:869-74.

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8. Radhakrishnan K. Platelet neutralization test. Methods Mol Biol 2013;992:349-51.

9. Martin BA, Branch DW, Rodgers GM. Sensitivity of the activated partial thromboplastin time, the dilute Russell's viper venom time, and the kaolin clotting time for the detection of the lupus anticoagulant: a direct comparison using plasma dilutions. Blood Coagul Fibrinolysis 1996;7:31-8.