Análisis genéticos

El diagnóstico de deficiencia congénita del factor (F) VII (FVII CD) se confirma con pruebas coagulométricas o pruebas cromogénicas de actividad del FVII. El diagnóstico de deficiencia congénita del FXIII (FXIII CD) se confirma con pruebas cromogénicas de actividad del FXIII y pruebas de antígenos del FXIII. La trombastenia de Glanzmann (GT) se diagnostica con pruebas de función plaquetaria. El defecto genético molecular subyacente puede entonces caracterizarse en laboratorios especializados.

Una vez confirmada la FVII CD mediante pruebas cromogénicas y/o pruebas coagulométricas de actividad del FVII(a), se puede llevar a cabo la caracterización del defecto genético molecular subyacente en laboratorios especializados. La genotipificación suele realizarse mediante la amplificación del ADN usando métodos basados en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y la posterior secuenciación para detectar mutaciones. Se ha descrito una gran variedad de polimorfismos y mutaciones del gen del FVII, incluidas mutaciones puntuales, contrasentido, terminadoras (o sin sentido) y en el sitio de empalme, pequeñas deleciones y reordenaciones.¹

Una vez se haya confirmado el diagnóstico de hemofilia A sobre la base de pruebas de actividad del FVIII por método cromogénico o de coagulación, se puede realizar la caracterización del defecto genético molecular de fondo en laboratorios especializados. El genotipado se suele realizar mediante la amplificación de ADN utilizando métodos basados en la reacción en cadena de la polimerasa (RCP) y una secuenciación posterior para detectar mutaciones y variantes estructurales.

Los resultados del genotipado se pueden utilizar, basándose en otras personas con la misma mutación, para predecir la gravedad de la hemorragia y el riesgo de desarrollar inhibidores. Una vez se haya definido la mutación genética en el paciente de referencia con hemofilia A, también es posible determinar entre familiares de sexo femenino el estado de portador, el cual se puede utilizar para fines de asesoramiento genético reproductivo y para estudios prenatales. Se han identificado al menos 2500 mutaciones en el gen FVIII, aunque puede que no todas las mutaciones afecten a la expresión o función del FVIII. Además, es posible que todavía queden por descubrir otras mutaciones funcionales nuevas.²

Una vez se haya confirmado el diagnóstico de hemofilia B sobre la base de pruebas de actividad del FIX por método cromogénico o de coagulación, se puede realizar la caracterización del defecto genético molecular de fondo en laboratorios especializados. El genotipado se suele realizar mediante la amplificación de ADN utilizando métodos basados en la reacción en cadena de la polimerasa (RCP) y una secuenciación posterior para detectar mutaciones y variantes estructurales.

Los resultados del genotipado se pueden utilizar, basándose en otras personas con la misma mutación, para predecir la gravedad de la hemorragia y el riesgo de desarrollar inhibidores. Una vez se haya definido la mutación genética en el paciente de referencia con hemofilia B, también es posible determinar entre familiares de sexo femenino el estado de portador, el cual se puede utilizar para fines de asesoramiento genético reproductivo y para estudios prenatales. Aunque puede que no todas las variantes genéticas afecten a la expresión o función del FIX, se han identificado al menos 1000 mutaciones en el gen FIX, y puede que todavía queden por descubrir otras mutaciones funcionales nuevas.³

Una vez se haya confirmado la DC FXI sobre la base de pruebas de actividad del FXI por método cromogénico o de coagulación, un laboratorio especializado puede caracterizar la anomalía genética de fondo. Las mutaciones en pacientes pertenecientes a poblaciones con un efecto del fundador conocido de DC FXI se pueden caracterizar mediante la amplificación de ADN de las regiones del gen que supuestamente albergan las mutaciones conocidas, utilizando métodos basados en la reacción en cadena de la polimerasa (RCP) y realizando una secuenciación posterior. En ausencia de antecedentes familiares de DC FXI o en ausencia de una posible mutación fundadora conocida, puede ser necesaria una secuencia molecular completa del gen FIX que incluya las regiones no codificantes que afectan a la transcripción o al empalme.⁴

Una vez que se ha confirmado la FXIII CD mediante pruebas cromogénicas y clasificado el subtipo con pruebas antigénicas del FXIII, se puede llevar a cabo la caracterización del defecto genético molecular subyacente en laboratorios especializados con fines investigativos solamente.^2,3 El análisis molecular puede identificar las variantes genéticas causales con la secuenciación completa de regiones exónicas y reguladoras de los genes F13A1 y F13B.⁴ La genotipificación se suele realizar mediante la amplificación del ADN usando métodos basados en la PCR y la posterior secuenciación para detectar mutaciones.

Una vez alcanzado el diagnóstico de GT mediante pruebas de función plaquetaria, este puede confirmarse con la caracterización del defecto genético molecular subyacente. La genotipificación se suele realizar mediante la amplificación del código de ADN genómico para los genes ITGA2B y ITGB3 , incluidos los 45 exones y los sitios de empalme relacionados, a través de métodos basados en la PCR y la posterior secuenciación para detectar mutaciones. Se ha descrito una gran variedad de polimorfismos y mutaciones que incluyen mutaciones contrasentido, terminadoras (o sin sentido) y en el sitio de empalme, pequeñas deleciones, inserciones e inversiones. Las mutaciones identificadas deben confirmarse con un segundo análisis de ADN.^5,6

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

La replicación de una región seleccionada de una molécula de ADN puede realizarse utilizando la PCR. Se mezcla la secuencia objetivo de ADN con ADN polimerasa, dos cebadores oligonucleótidos y nucleótidos. Una sola molécula del ADN objetivo es suficiente para que la PCR amplifique grandes cantidades del segmento de ADN entre los cebadores oligonucleótidos. Los cebadores están diseñados para adherirse al ADN objetivo a cada lado del segmento que debe amplificarse y deben iniciar la síntesis de ADN con la ADN polimerasa, que incorpora los nucleótidos complementarios al ADN molde.

Vista general de la amplificación de una secuencia de ADN definida mediante PCR.

Secuenciación

Si bien la secuenciación de ADN suele ser un proceso automatizado, el método sobre el que se basa es generalmente el método de Sanger. Se utilizan moléculas de ADN de una sola hebra que contienen el segmento genético que se secuenciará, por ejemplo, amplificado por la PCR, como molde donde se alineará un pequeño cebador oligonucleótido en la misma posición en cada molécula. El cebador es el punto de inicio para que la ADN polimerasa sintetice la hebra de ADN complementario incorporando desoxirribonucleótidos trifosfato (dNTPs). Además de los cuatro dNTP, se agrega a la mezcla una pequeña cantidad de los cuatro dideoxinucleótidos (ddNTPs), cada uno marcado con un fluoróforo diferente. Estos conducen a la terminación de la síntesis de ADN al incorporarse en la cadena en crecimiento en las distintas posiciones porque carecen del grupo 3’-hidroxilo que se necesita para la polimerización posterior del siguiente nucleótido. Esto produce un conjunto de cadenas de distintas longitudes, cada una de las cuales termina con uno de los cuatro ddNTP marcados fluorescentemente. Las distintas cadenas se separan unas de otras mediante electroforesis en gel de poliacrilamida, que puede separar las moléculas de ADN de distintas longitudes por tan solo un nucleótido. La secuencia de ADN se puede establecer a partir de la secuencia de bandas fluorescentes en el gel de electroforesis.

1. Lapecorella M, Mariani G, International Registry on Congenital Factor VIID. Factor VII deficiency: defining the clinical picture and optimizing therapeutic options. Haemophilia 2008;14:1170-5.

2. Bolton-Maggs PH, Favaloro EJ, Hillarp A, Jennings I, Kohler HP. Difficulties and pitfalls in the laboratory diagnosis of bleeding disorders. Haemophilia 2012;18 Suppl 4:66-72.

3. Kohler HP, Ichinose A, Seitz R, et al. Diagnosis and classification of factor XIII deficiencies. J Thromb Haemost 2011;9:1404-6.

4. Biswas A, Ivaskevicius V, Thomas A, Oldenburg J. Coagulation factor XIII deficiency. Diagnosis, prevalence and management of inherited and acquired forms. Hamostaseologie 2014;34:160-6.

5. Nurden AT, Pillois X, Wilcox DA. Glanzmann thrombasthenia: state of the art and future directions. Semin Thromb Hemost 2013;39:642-55.

6. Solh T, Botsford A, Solh M. Glanzmann's thrombasthenia: pathogenesis, diagnosis, and current and emerging treatment options. J Blood Med 2015;6:219-27.