Las pruebas cromogénicas de actividad del FVII se basan en el mismo principio que las pruebas de actividad de coagulación del FVII; la única diferencia importante es el parámetro utilizado para cuantificar la actividad del factor. Se han desarrollado dos tipos de pruebas cromogénicas; ambas emplean un sustrato específico para FXa a fin de cuantificar la actividad enzimática anterior.
En la versión convencional de la prueba cromogénica del FVII, el
zimógeno FVII se convierte primero en FVIIa en presencia de la
tromboplastina y el calcio, luego, se mide la concentración total del
FVII(a) como una función de la actividad del FXa. Una versión más
reciente de la prueba cromogénica del FVII mide específicamente la
actividad del FVIIa en una muestra de plasma citratado. Un factor
tisular soluble truncado, recombinante (sTF) se enlaza al
FVIIa, pero no es capaz de activar el zimógeno FVII. En presencia de
fosfolípidos y calcio, el complejo sTF-FVIIa activa el FX y el FXa
escinde un sustrato peptídico específico. Otra variante de esta prueba
utiliza un anticuerpo específico para FVIIa. La actividad del FXa en
la prueba es directamente proporcional a la actividad del FVIIa. El
uso de fosfolípidos sintéticos ha reducido la interferencia de las
impurezas y ha mejorado la especificidad de la prueba, particularmente
en el rango de baja concentración.1
Representación esquemática de la prueba cromogénica del FVIIa.
Las pruebas cromogénicas de actividad del FVIII derivan de las pruebas de coagulación de dos etapas2,3 y pueden utilizarse para medir la actividad funcional del FVIII. En la prueba cromogénica de actividad del FVIII, la primera etapa consiste en mezclar el plasma de prueba con trombina (FIIa) o protrombina (FII), FIXa, FX, fosfolípidos y calcio, lo que conduce a la activación del FX (FXa). Durante la segunda etapa, se añade un inhibidor de trombina y un sustrato cromogénico específico para FXa, y los niveles de actividad del FXa se cuantifican monitoreando la segmentación del sustrato peptídico cromogénico.4
Representación esquemática de la prueba cromogénica del FVIII.
En la prueba cromogénica de actividad del FIX, la primera etapa consiste en mezclar el plasma de prueba con FXIa, FVIII, trombina (FIIa), protrombina (FII), FX, fosfolípidos y calcio, lo que conduce a la activación dependiente del FIX del FX (FXa). Durante la segunda etapa, se añade un inhibidor enzimático no objetivo (distinto del FXa) y un sustrato cromogénico específico para FXa, y los niveles de actividad del FXa se cuantifican monitoreando la segmentación del sustrato peptídico cromogénico.4
Representación esquemática de la prueba cromogénica del FIX.
La Subcomisión de la SSC dedicada al Factor XIII y Fibrinónego de la Asociación Internacional de Trombosis y Hemostasia (ISTH)5 recomienda las pruebas de actividad del FXIII como prueba de "primera línea" para diagnosticar la deficiencia del FXIII. Se basan en dos principios: la medición de la liberación de amoníaco durante el primer paso de la reacción de transglutaminasa y la medición de la amina marcada que se entrecruza de forma covalente con un sustrato de proteína por el FXIII activado (FXIIIa).5-8 La prueba fluorométrica más nueva se basa en la actividad de la isopeptidasa del FXIIIa.7,8
Prueba de liberación de amoníaco
En la prueba de liberación de amoníaco, el amoníaco producido
durante la reacción de transglutaminasa en la que el FXIIIa actúa de
mediador se mide espectrofotométricamente mediante la reacción de un
indicador mediado por glutamato dehidrogenasa (GIDH) en la cual la
nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADPH) se convierte en
NADP.5,7,8 En principio, la trombina y el
Ca2+ activan el FXIII en el plasma y un péptido inhibidor
de la polimerización de la fibrina inhibe la coagulación del
plasma.5,8 Luego, el FXIIIa entrecruza un sustrato de amina
con un residuo de glutamina en un oligopéptido, donde se libera el amoníaco.5,8
1. Activación durante la etapa de retardo:
2. Reacción de transglutaminasa:
3. Monitoreo de la liberación de amoníaco:
Principio de la prueba fotométrica de liberación de amoníaco para medir la actividad del FXIII.8
Dado que otras reacciones que consumen NADPH y producen amoníaco y son independientes del FXIII activado están presentes en el plasma, es posible que se produzca la sobreestimación de la actividad del FXIII, un problema especialmente significativo en el rango de baja actividad.5,7,8 Por consiguiente, se requiere una muestra blanco de plasma paralela y el valor blanco se debe restar del valor de prueba a fin de determinar la actividad del FXIII de forma precisa.5,7,8 Otra desventaja de las pruebas de liberación de amoníaco es que tienen una sensibilidad relativamente baja con un límite de cuantificación de entre 3% y 5%.5,8
Prueba de incorporación de amina
En la prueba de incorporación de amina, los sustratos de amina con
marcado radioactivo o biotinilado fluorescentes se entrecruzan de
forma covalente a un residuo de glutamina de un sustrato de proteína
mediante el FXIIIa. Las moléculas de sustrato de amina no unidas
libres se separan entonces de la fracción unida a
proteínas.5,8 Esta última se cuantifica midiendo los
sustratos de amina fluorescentes o con marcado radioactivo
incorporados o usando una reacción enzimática mediada por
estreptavidina en caso de aminas biotiniladas.8 Al igual
que en la prueba de liberación de amoníaco, la trombina y el
Ca2+ son mediadores de la activación inicial del FXIII.5
1. Activación durante el curso de la reacción:
2. Reacción de transglutaminasa:
3. Determinación de amina incorporada:
Principio de la prueba de incorporación de amina para medir la actividad del FXIII.
Las pruebas de incorporación de amina fueron las primeras pruebas
cuantitativas del FXIII utilizadas para determinar la actividad del
FXIII y son muy sensibles, algunas pueden detectar niveles de
actividad del FXIII en el plasma por debajo de 1 IU/dL
(%).8 No obstante, su desventaja es que consumen bastante
tiempo, son difíciles de estandarizar y el paso de separación hace que
apenas sea posible diseñar una prueba cinética
verdadera.5,8 Además, el polimorfismo Val34Leu del FXIII-A común a la
población caucásica puede influenciar esos tipos de pruebas de
incorporación de aminas que miden la actividad de la transglutaminasa
en la etapa inicial de la activación del FXIII.5,8 En
cambio, las pruebas de incorporación de amina que miden la actividad
de la transglutaminasa de la enzima totalmente activada no resultan
afectadas por este polimorfismo.5,8
Pruebas fluorométricas
La prueba fluorométrica más nueva se basa en la actividad de la
isopeptidasa del FXIII activado bajo ciertas condiciones en las cuales
la enzima puede liberar aminas primarias unidas a un residuo de
glutamina en un oligopéptido.8 La eliminación gradual de la
amina, que contiene un inhibidor de la fluorescencia, conduce a una
mayor fluorescencia del sustrato peptídico, que está marcado con un
fluoróforo.8 Sin embargo, en comparación con las pruebas de
liberación de amoníaco, la prueba fluorométrica tiene una sensibilidad
incluso inferior y los resultados de la prueba no están bien correlacionados.8
Principio de la prueba fluorométrica de isopeptidasa para medir la actividad del FXIII.
