抑制物检测

Bethesda法可对血浆标本中抑制性抗体的滴度进行定量检测。狼疮抗凝剂(LA)检测可用于发现有无抗磷脂抗体的存在。

Bethesda¹法可对血浆标本中抑制性抗体的水平进行定量检测。通过将连续稀释的待测血浆与正常血浆混合，待测血浆中的任何抑制性同种抗体或自身抗体将中和正常血浆中的FVIII或FIX（或其他凝血因子）的活性。对含抑制物的待测血浆充分稀释后，正常血浆中的FVIII或FIX活性可被检测出，从而根据残余的因子活性和样本稀释的倍数对抑制物进行定量分析。改良Bethesda法（Nijmegen法）²降低了假阳性结果的发生率，目前已被广泛用于抑制物的定量检测。

改良Bethesda法（Nijmegen法）

将待测血浆采用乏FVIII血浆进行连续稀释后，与经0.1M咪唑（pH7.4）缓冲的正常人混合血浆进行等量混合。正常血浆与免疫吸附的乏因子血浆混合做为阴性对照（无抑制物；100%活性）。孵育后，通过活化部分凝血活酶时间(aPTT)的标准一期凝固法测量残余因子活性。

改良Bethesda法（Nijmegen法）抑制物滴度定量测定的原理。

抑制物滴度计算

在37℃下经2小时孵育，能中和正常血浆一单位（1 IU/mL）FVIII 50%活性的血浆样本其抑制物的含量定义为1个Bethesda单位(BU)。存在抑制物的情况下测量FIX活性原理与FVIII相同，但不需孵育。以残余因子活性最接近对照混合血浆50%（25%~75%之间）的稀释度来计算抑制物的滴度。一般而言，若残余因子活性>80%则认为不存在抑制物。

例如，当待测血浆按1：16倍稀释后其残余因子活性为对照混合血浆的50%，则该标本中抑制物滴度为16BU（50%活性为 1个 BU，再乘以16倍的稀释度）。抑制物滴度也可通过将BU与残余因子活性绘制坐标图后再乘以标本的稀释倍数而得出。

抑制物动力学

血友病A（HA）或B（HB）患者接受因子浓缩物替代治疗后产生的同种抗体，通常具有线性I型动力学特征。³该抑制物可完全中和FVIII或FIX活性。

相反，获得性血友病A(AHA)患者出现的自身抗体通常呈非线性、II型动力学特征。即使高滴度抑制物亦不能完全中和因子活性。³如缺乏个人经验，建议在咨询具有相应经验的专家后再对自身抗体的动力学进行评估。

对于可测出残余FVIII活性的患者，需注意Nijmegen改良法对抑制物检测的准确性下降。对于这些患者，增加热灭活步骤可提高检测的准确性。⁴

狼疮抗凝物（LA；2017 ICD-10-CM：D68.312）是一类可与磷脂和细胞膜表面蛋白结合并产生促栓效应的自身抗体。和体内相反，由于其可与反应体系中的磷脂相结合，LA在体外反而可导致aPTT的延长。⁵

确认是否存在LA的敏感试验包括稀释蝰蛇毒时间(dRVVT)、血小板中和试验(PNP)和白陶土凝固时间(KCT)。

稀释蝰蛇毒时间⁶

蝰蛇毒(RVV)可直接激活FX，后者在FVa和磷脂存在的情况下进而将凝血酶原转化为凝血酶。

正常人混合血浆或待测血浆在37℃下与磷脂共同孵育，然后加入稀释的RVV和钙以启动凝血，继而测定血浆的凝固时间。正常血浆与待测血浆凝血时间的比值可用于判定有无LA的存在。如能排除共同凝血途径因子（I、II、V、X）的缺乏，比值>1.05则提示LA的存在。

狼疮抗凝物通过与磷脂结合可干扰凝血反应并导致凝血时间延长。正常血浆纠正试验是将待测血浆与正常血浆1：1混合，如凝血时间延长可被纠正则提示因子缺乏。由于RVV可直接活化FX，该检测不受内源性（接触激活）凝血途径的影响。如凝血时间延长不能被正常血浆纠正，但可被过量磷脂纠正，则提示LA存在。

硅凝固时间

硅凝固时间(SCT)基于aPTT检测，使用二氧化硅作为接触激活剂，在乏血小板血浆和低浓度磷脂条件下加入钙进行检测。SCT是对LA敏感的筛查试验之一。⁷

血小板中和试验⁸

血小板中和试验是指采用洗涤并溶破的血小板膜作为过量的磷脂来源以中和LA的效应，观察aPTT是否可以恢复正常。

白陶土凝固时间⁹

KCT亦对LA敏感，其原理同aPTT。区别在于KCT不加入磷脂，而以血浆中的脂质和细胞膜碎片做为磷脂成分的来源。该检测可用于检测所有类型的凝血抑制物，包括抗磷脂抗体和FVIII抗体。

将正常血浆和患者血浆按1:10至10:1的比例进行混合，加入白陶土和钙后测定凝血时间。如检测样本与对照凝血时间的比值>1.2则提示抑制物的存在。如加入过量正常血浆KCT仍延长，可排除因子缺乏；在凝血因子水平正常的前提下，如KCT不能被纠正，则提示存在包括凝血因子自身抗体在内的凝血抑制物。可采用Rosner指数或Chang比率来判定KCT是被纠正或未被纠正。

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